口蹄疫滅活疫苗內(nèi)毒素和總蛋白測(cè)定法(中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2078號(hào))

時(shí)間：2019-07-14 20:37:03來(lái)源：food欄目：食品法規(guī) 閱讀：

發(fā)布單位	農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)部	發(fā)布文號(hào)	農(nóng)業(yè)部公告第2078號(hào)
發(fā)布日期	2014-03-12	生效日期	暫無(wú)
有效性狀態(tài)		廢止日期	暫無(wú)
備注

根據(jù)《獸藥管理?xiàng)l例》和《獸藥注冊(cè)辦法》規(guī)定，我部組織制定了口蹄疫滅活疫苗內(nèi)毒素和總蛋白測(cè)定法，現(xiàn)予發(fā)布，自發(fā)布之日起執(zhí)行。

特此公告。

附件：1.口蹄疫滅活疫苗內(nèi)毒素測(cè)定法

2.口蹄疫滅活疫苗總蛋白測(cè)定法

農(nóng)業(yè)部

2014年3月12日

附件1

口蹄疫滅活疫苗內(nèi)毒素測(cè)定法

吸取12 ml疫苗放入15 ml離心管中，置50±5℃水浴90分鐘，然后在4℃條件下，以15000 g離心10分鐘，取水相5.0 ml，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》一部附錄進(jìn)行檢驗(yàn)。每頭份疫苗中內(nèi)毒素含量應(yīng)不高于50 EU。

附件2

口蹄疫滅活疫苗總蛋白測(cè)定法

取1瓶疫苗恢復(fù)至室溫，在3個(gè)1.5ml離心管中分別精確加入100μl疫苗和900μl丙酮，充分混勻，室溫放置10分鐘，在4℃條件下，以15000g離心15分鐘。吸棄液相，沉淀物用400μl丙酮洗滌2次，室溫干燥約15分鐘，加50μl去離子水復(fù)溶后，按附注進(jìn)行檢驗(yàn)。每毫升疫苗總蛋白含量應(yīng)不高于500μg。

附注：口蹄疫滅活疫苗總蛋白測(cè)定法

1.方法與原理

本法適用于口蹄疫病毒油佐劑滅活疫苗總蛋白含量檢測(cè)。本法系福林酚法(lowry法)，依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與Cμ2+螯合形成蛋白質(zhì)－銅復(fù)合物，此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，同時(shí)在堿性條件下酚試劑易被蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸還原呈藍(lán)色反應(yīng)。在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用比色法測(cè)定供試品中蛋白質(zhì)的含量。

2.試劑與儀器

2.1試劑丙酮（分析純）、無(wú)菌去離子水、商品化Lowry法改良試劑盒；

2.2設(shè)備酶標(biāo)儀（全波長(zhǎng)），“Μ”型96孔板，卡介苗注射器，單通道和多通道移液器，渦旋震蕩儀，酶標(biāo)板振蕩器等。

3.操作步驟

3.1標(biāo)準(zhǔn)系列稀釋液制備將商品化試劑盒內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（2mg/ml母液），按下表依次稀釋。

編號(hào)	1	2	3	4	5	6	7	8	9
母液（μl）	0	5	25	50	100	150	200	300	400
去離子水（μl）	400	395	375	350	300	250	200	100	0
終濃度（μg/ml）	0	25	125	250	500	750	1000	1500	2000

3.2檢驗(yàn)疫苗處理取1瓶疫苗恢復(fù)至室溫?fù)u勻后，在3個(gè)1.5 ml離心管中分別精確加入100μl疫苗和900μl丙酮，充分混勻，室溫放置10分鐘，在4℃條件下，以15000 g離心15分鐘。吸棄液相，沉淀物用400μl丙酮洗滌2次，室溫干燥約15分鐘，加50μl去離子水復(fù)溶備用。

3.3反應(yīng)板加樣與讀數(shù)

3.3.1各取3.1稀釋的各濃度牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液40μl，以及三重復(fù)待檢疫苗樣品40μl，分別加入到96孔板內(nèi)。用排槍迅速加入200μl改良lowry法試劑盒內(nèi)試劑，立即用振蕩器混勻30秒；

3.3.2封膜，室溫孵育10分鐘；

3.3.3各孔內(nèi)分別加入20μl 1倍酚試劑（試劑盒內(nèi)為2倍，用前用去離子水現(xiàn)稀釋），立即用振蕩器混勻30秒；

3.3.4封膜，室溫孵育30分鐘；

3.3.5酶標(biāo)儀測(cè)定750nm吸光值，保存讀數(shù)。

3.4數(shù)據(jù)處理

根據(jù)系列標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋液的濃度（0μg/ml～2000μg/ml）和750nm吸光值，使用EXCEL以吸光值為X軸，以蛋白標(biāo)準(zhǔn)濃度為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)趨勢(shì)線求得多項(xiàng)式，其多項(xiàng)式R2≥0.98。

將被檢樣品的吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)蛋白獲得的多項(xiàng)式，計(jì)算樣品中蛋白含量，根據(jù)取樣量求得1ml樣品中蛋白含量。例如口蹄疫滅活疫苗水相/油相比例為1:1，免疫劑量為2ml時(shí)，100μl疫苗經(jīng)丙酮沉淀后用50μl去離子水復(fù)溶，測(cè)得濃度即為每頭份疫苗中蛋白濃度，或2ml疫苗中蛋白濃度。結(jié)果判定時(shí)，將測(cè)定值除以2即得每毫升疫苗中總蛋白含量。

3.5結(jié)果判定

若測(cè)定結(jié)果為每毫升疫苗總蛋白含量小于或等于500μg，則判定被檢疫苗總蛋白含量符合規(guī)定；若測(cè)定結(jié)果為每毫升疫苗總蛋白含量大于500μg，判定被檢疫苗總蛋白含量不符合規(guī)定。

3.6檢測(cè)數(shù)據(jù)處理舉例

3.6.1收集數(shù)據(jù)如表所示

Value	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	0.102	0.149	0.336	0.504	0.836	1.122	1.334	1.702	1.923	--	--	--
B	0.677	1.722	0.252	1.116	2.167	1.020	--	--	--	--	--	--
C	0.640	1.704	0.230	1.050	2.195	0.962	--	--	--	--	--	--
D	0.641	1.716	0.225	1.061	2.175	1.012	--	--	--	--	--	--
E	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--
F	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--
G	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--
H	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--

上述表格中，A1-A9為系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液，A1至A9蛋白濃度依次增高；B、C、D行中1-6列為檢測(cè)樣品750nm吸光值，B1-B6為6批不同批次疫苗樣品，每一列為同一疫苗樣品三個(gè)重復(fù)。

3.6.2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：將上表中數(shù)據(jù)復(fù)制到EXCELL表格中，

Value	1	2	3	4	5	6	7	8	9
OD750	0.102	0.149	0.336	0.504	0.836	1.122	1.334	1.702	1.923
蛋白濃度μg/ml	0	25	125	250	500	750	1000	1500	2000

采用EXCEL程序，選中1-9列對(duì)應(yīng)的兩行數(shù)據(jù)→“插入”→“散點(diǎn)圖”，選擇“帶平滑線和數(shù)據(jù)標(biāo)記的散點(diǎn)圖”，得到以750nm吸光值為X軸，以蛋白濃度為Y軸的曲線圖。選擇“圖表工具”中“布局”→ “趨勢(shì)線”→“其他趨勢(shì)線選項(xiàng)”，選中“多項(xiàng)式”、“顯示公式”和“顯示R平方值”。通常R平方值大于等于0.98表明標(biāo)準(zhǔn)曲線可信。每一塊96孔板應(yīng)設(shè)一組標(biāo)準(zhǔn)并繪制相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.6.3數(shù)值計(jì)算

以樣品測(cè)定OD750值為X，代入y = 411.69x2+ 220.65x - 3.9423，Y為蛋白濃度，以表中第一批疫苗測(cè)定結(jié)果為例。該疫苗三重復(fù)測(cè)定的OD750數(shù)據(jù)（X）分別為：0.677、0.640、0.641，代入公式計(jì)算蛋白含量（Y）分別為：334μg/ml、306μg/ml、307μg/ml，該數(shù)據(jù)為每毫升水相抗原中總蛋白含量。計(jì)算三重復(fù)數(shù)值的平均值（AVERAGE）為316μg/ml，標(biāo)準(zhǔn)差（STDEV.P）為13.1，變異系數(shù)為4.15%（標(biāo)準(zhǔn)差/平均值*100%），將每毫升水相抗原中總蛋白含量，除以2折算為每毫升疫苗總蛋白含量，該疫苗的總蛋白含量為138μg/ml。按照上述方法，可計(jì)算其他樣品的總蛋白含量。

3.6.4結(jié)果判定

同一樣品不同重復(fù)間變異系數(shù)應(yīng)小于5.3%，否則試驗(yàn)不成立，應(yīng)重做。若測(cè)定值小于或等于500μg/ml，則判定被檢疫苗總蛋白含量符合規(guī)定；若測(cè)定值大于500μg/ml，則判定被檢疫苗總蛋白含量不符合規(guī)定。