食品伙伴網注：本方法源自奶牛乳房炎防治技術指南(試行)（農醫發[20l0]29號）

1主要試劑和試驗方法：

1.1革蘭氏染色：

1.1.1涂片、火焰固定。

1.1.2草酸銨結晶紫染1min。

草酸銨結晶紫染液的配制：

溶液A：結晶紫2g，95％酒精20mL，溶液B：草酸銨0.8g，蒸餾水80mL。將A、B溶液混合，用濾紙過濾后即可使用。

1.1.3自來水沖洗。

1.1.4加碘液覆蓋涂面染約1min。

1.1.5水洗，用吸水紙吸去水分。

1.1.6加95％酒精數滴，并輕輕搖動進行脫色，20s后水洗，吸去水分。

1.1.7沙黃液（稀）染2min后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。

革蘭氏陽性菌染色為藍色，革蘭氏陰性菌染色為紅色。

1.2觸酶試驗：取槽置于潔凈的試管內或玻片上，然后加3％過氧化氫數滴；或直接滴加3％過氧化氫于不含血液的細菌培養物中，立即觀察結果。有大量氣泡產生者為陽性，無則為陰性。

1.3血漿凝固酶試驗：吸取0.5mI。兔血漿與0.5mlj金黃色葡萄球菌浸液肉湯24h培養物充分混勻，置36±1℃培養，每隔半小時觀察一次，連續觀察6h，出現凝固，即將小試管傾斜或倒置時，內容物不流動，判為陽性。同時做陰陽性對照。

2乳樣的采集

選取出現臨床癥狀（或者懷疑為亞臨床型乳房炎）乳房炎奶牛，先用溫水，再用0.2％新潔爾滅擦洗乳房，最后用70％的酒精擦拭乳頭。采樣者同時進行手指擦拭消毒。每個乳室先擠去頭2-3把奶，以排除污染的雜菌，每頭奶牛取乳樣5mI.于無菌乳樣杯中，待檢。

3病原菌的分離培養

初步診斷：將少量乳汁涂片、革蘭氏染色、鏡檢。如發現圓球形革蘭氏陽性細菌可懷疑為葡萄球菌。

分離培養：將乳樣搖勻，分別取適量接種于營養肉湯（10％血清）、鮮血瓊脂、麥康凱瓊脂培養基（平板）后，置于37℃溫箱培養24～48h。觀察每個平板中細菌生長的情況，記錄菌落生長表現。

普通瓊脂平板上，37℃，24～72h培養后，可見到濕潤、光滑、隆起的圓形金黃色菌落。挑取典型菌落涂片、染色、鏡檢（鏡檢呈葡萄狀排列，無芽胞、莢膜，直徑0.5～lμm，革蘭氏染色陽性），并挑取單個可疑菌落移植于肉湯和斜面培養基，經37℃培養24～48h。24h后沒有長菌的平板，再用相應的增菌肉湯涂劃一次，繼續培養，24～48h后，再作檢查，以防漏檢。將剩余的乳樣存放于4℃冰箱內備用。

營養肉湯中呈渾濁生長，管底有少量灰白色沉淀；

血液瓊脂平板中菌落較大，呈金黃色、圓形，周圍出現明顯的β-溶血。

4生化鑒定

觸酶試驗：觸酶陽性

血漿凝固酶試驗：凝固酶試驗陽性

糖發酵試驗：能分解甘露醇、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖

色素產生情況：能產生金黃色色素

5毒力試驗

將上述經過生化試驗鑒定的細菌懸液用滅菌生理鹽水作適當稀釋，對隨機分組的小鼠進行腹腔注射接種，接種量為0.5mL／只（家兔皮下接種1.0mL或者靜脈接種0.1～0.5mL），能夠致死動物或者內臟出現膿腫可以確定有毒力。

6病原菌的重分離試驗

對接種后發病、死亡小鼠（家兔）的肝臟進行病原菌重分離。進行菌落涂片、革蘭氏染色、顯微鏡檢查，觀察所分離菌株是否為原接種菌。如果是則進一步確定病原菌為金黃色葡萄球菌。

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